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Jornalista: Fabiana Mariz, do Jornal da USP
03/11/19 - A hemorragia pulmonar vem sendo descrita como o sintoma mais grave e emergente em pacientes com leptospirose. Enquanto a letalidade para os casos notificados da doença é de 10%, pessoas que desenvolvem essa complicação têm 50% de chance de sobreviver.
Entender como os sangramentos surgem no organismo foi o foco do trabalho de Luís Guilherme Virgílio Fernandes, vencedor do Prêmio Tese Destaque USP 2019 na categoria Multidisciplinar. Sob orientação de Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento, do Instituto Butantan, o biotecnólogo trouxe informações inéditas sobre a patogênese e apontou caminhos para o desenvolvimento de novas terapias. "Apesar de a leptospirose ter sido identificada mais de cem anos atrás, há ainda muito a ser desvendado", comenta Ana Nascimento.
Trabalhos anteriores mostraram que, quando as leptospiras estão no sangue, elas capturam a trombina, a enzima-chave da cascata de coagulação, impedindo sua atividade. Assim, há menos formação de coágulo e mais hemorragia. A pesquisa de Luís Fernandes, foi além: "Fomos o primeiro grupo a ver que a ligação das bactérias com o fibrinogênio inibia a formação do coágulo de fibrina", explica Ana Nascimento. "Sabíamos que algumas proteínas mediavam o processo, mas investigamos como isso de fato ocorre", diz a professora.
Hélio Bacha, consultor da Sociedade Brasileira de Imunologia, explica que o sangramento pulmonar é muitas vezes associado aos casos de sepse, um tipo de inflamação sistêmica. "A interação das leptospiras com a trombina nos dá um novo marcador de gravidade da doença, sendo muito importante na área clínica", destaca ele.
Outra parte importante do trabalho, segundo Ana, foi o estudo dos efeitos dos anti-inflamatórios por meio de experimento em que roedores foram infectados pelas leptospiras. "Os benefícios não estavam muito claros e o Luís mostrou experimentalmente como os medicamentos anti-inflamatórios poderiam reduzir as hemorragias."
Luís Fernandes espera que os resultados abram caminhos para o desenvolvimento de novas terapias. "Identificando as substâncias responsáveis pela hemorragia, conseguiremos produzir proteínas recombinantes para desenvolver vacinas ou, ainda, melhorar as formas de diagnóstico da leptospirose", projeta ele.
O estudo foi realizado na Pós-graduação Interunidades em Biotecnologia USP - Instituto Butantan - Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT).
Sistema complexo
A coagulação sanguínea é o processo de transformação do sangue líquido em um gel sólido. É ativada sempre que ocorre o rompimento de algum vaso sanguíneo. Plaquetas, proteínas de coagulação e anticoagulantes naturais são alguns dos componentes envolvidos nesse mecanismo. O sistema é complexo e se dá por uma sequência de eventos químicos regulados simultaneamente para equilibrar a perda excessiva de sangue e a formação de trombos vasculares.
Após a lesão do vaso, as plaquetas formam um tampão no local. É a chamada hemostasia primária. A hemostasia secundária é caracterizada pela ativação dos fatores de coagulação - componentes do plasma, numerados de I a XII, que trabalham para formar fibras de fibrina e fortalecer o tampão plaquetário.
As ações subsequentes acontecem em "Y", ou seja, em duas vias. A primeira, conhecida como Intrínseca (ou via de contato), é composta de elementos do sangue e de outros que não são frequentemente encontrados no espaço intravascular. Inicia-se pelo Fator XII .
A outra, Extrínseca, ocorre quando o sangue sai do vasos para os tecidos conjuntivos - grupos responsáveis por unir, ligar, nutrir, proteger e sustentar os outros tecidos. É iniciada pelo fator tissular, FT, e pelo fator VII ativado, o FVIIa.
Ambas convergem para uma via final comum por meio da formação de FXa, que age sobre a molécula de protrombina e a converte em trombina. Protrombina é uma proteína encontrada no plasma e sintetizada no fígado. É ativada à trombina a partir de uma reação química. Já a trombina é a enzima-chave da cascata de coagulação, gerada a partir de sua forma inativa (protrombina) por meio de uma clivagem mediada pelo fator Xa. Ela é responsável pela formação do coágulo de fibrina, que estanca o sangramento.
As plaquetas entram em ação na etapa seguinte. Agem também na formação de fibrina e reforçam esse "plug plaquetário".
Outros estudos haviam mostrado que, quando as leptospiras estão no sangue, elas capturam a trombina, impedindo atividade da enzima. Como consequência, há menos formação de coágulo e mais hemorragia. "A pesquisa do Luís se debruçou nesse sistema para descobrir quais mecanismos as bactérias patogênicas utilizam para inibir a atividade da trombina", explica Ana.
Leptospirose no mundo
A leptospirose é uma doença infecciosa causada por bactérias chamadas leptospiras. É transmitida direta ou indiretamente de animais para seres humanos pela urina de roedores, principalmente após enchentes. Ocorre mais frequentemente em locais com condições sanitárias precárias e alta infestação de roedores infectados.
A incidência varia de um para cada 100 mil pessoas por ano em países de clima temperado e de 10 para 100 mil nos trópicos. Diante de eventos climáticos, esse número chega a aumentar dez vezes. Os dados são da Organização Mundial da Saúde.
Os principais sintomas da doença são febre, dores de cabeça, dores pelo corpo - principalmente nas panturrilhas -, além de vômitos, diarreia e tosse. Nos casos mais graves, infectados desenvolvem icterícia, insuficiência renal e hemorragia. A letalidade das formas mais graves é de aproximadamente 10% e chega a 50% quando ocorre a síndrome de hemorragia pulmonar.
O gênero Leptospira compreende espécies patogênicas e saprofíticas e a mais importante delas é a L. interrogans. Mais de 200 variedades — ou sorovares, como são conhecidas no meio científico — já foram identificadas. No Brasil, os sorovares Icterohaemorrhagiae e Copenhageni frequentemente estão relacionados aos casos mais graves.
Entendendo mecanismos
No início da pesquisa, Luís Fernandes queria saber se as bactérias interagiam com a protrombina e com a trombina. Foram utilizadas duas cepas de L. interrogans sorovar Copenhageni — uma virulenta e outra atenuada em cultura — e outra de L. biflexa sorovar Patoc, não patogênica.
Não houve interação dos patógenos com a protrombina, mas a cepa virulenta foi a que se ligou muito mais à trombina. O passo seguinte foi realizado para caracterizar essa interação. "Colocamos concentrações aumentadas de trombina, vimos em quanto tempo essa ligação acontecia e qual região dessa enzima era capturada pelas leptospiras."
A trombina possui locais inacessíveis, que se tornam expostos quando ativados. O sítio catalítico é o responsável, entre outras coisas, por clivar, quer dizer, cortar substratos. Já o exosítio 1 é o sítio de reconhecimento desses componentes.
Como a trombina é produzida em concentrações muito pequenas no organismo, ela ativa outros fatores que aumentam a sua produção - processo conhecido como feedback positivo. Funciona mais ou menos assim: o coágulo desenvolve um círculo vicioso para promover mais coagulação. Todas as substâncias utilizadas pela enzima para ativar seu feedback são reconhecidas via exosítio 1.
O pesquisador queria descobrir, então, qual desses dois sítios era bloqueado durante a infecção. Leptospiras virulentas foram incubadas com altas concentrações de trombina e, à solução, foram adicionados inibidores da enzima. "Quando bloqueávamos o exosítio 1, a leptospira parava de se ligar à trombina, sugerindo a participação dessa região na ligação", explica Fernandes. "O bloqueio do exosítio 1 faria com que a trombina parasse de reconhecer seus substratos, entre eles o fibrinogênio e o Fator V, cuja forma ativada (FVa) participa do feedback de geração de trombina."
"Demonstramos essa interrupção também experimentalmente", adiciona o pesquisador. Três cepas — virulenta, atenuada e saprofítica — foram pré-incubadas com trombina e fibrinogênio. "Notamos a formação de menos coágulo e de coágulos mais 'frouxos'."
Mais experimentos
Pacientes com dengue apresentam, durante a fase inicial da infecção, altos níveis de anticorpos anti-NS1 (proteína do vírus), que reagem de maneira cruzada com componentes da coagulação do hospedeiro (auto-anticorpos). "Parti para investigar se na leptospirose acontecia a mesma coisa", comenta Fernandes. "O esperado era que, no início da infecção, encontraríamos também auto-anticorpos e menos atividade da enzima."
Amostras de soros de pacientes saudáveis, infectados na fase inicial e na convalescênça da doença, foram incubadas com trombina comercial. Os resultados surpreenderam. Soro de paciente saudável inibiu completamente a trombina, mostrando que os componentes estavam em homeostase. Já com o material de pacientes doentes aconteceu o inverso. "Conforme a infecção avançava, os níveis de inibidores caíam e qualquer quantidade de trombina adicionada mantinha a atividade." Esse foi o primeiro indício de que os fatores e os inibidores eram consumidos na infecção.
Antitrombina
Um desses inibidores é a antitrombina. Níveis reduzidos dessa substância são encontrados em pacientes com sepse, por exemplo. Alguns autores sugerem o desenvolvimento da CID (Coagulação Intravascular Disseminada) durante a leptospirose, reflexo de uma coagulação desenfreada, sem regulação final e com constante consumo dos componentes da cascata de coagulação. "A análise de soro de pacientes mostrou que, novamente, à medida que a infecção avançava, a antitrombina caía", relata Luís Fernandes. "Isso mostra que, se há menos inibidores, há também menos fatores agindo."
Fernandes analisou o montante de protrombina em soro de indivíduos enfermos e os resultados foram muito parecidos com os anteriores. O pesquisador sugeriu, a partir desses dados, que poderia estar havendo um mecanismo indireto da resposta do hospedeiro.
Na fase final do trabalho, o cientista infectou hamsters com amostras virulentas de L. interrogans sorovar Kennewick cepa Pomona Fromm e L. interrogans sorovar Canicola - mais hemorrágica que a anterior - e monitorou o soro desses animais por até 21 dias. Hamsters inoculados com solução salina foram usados como controle.
Animais infectados com a cepa menos hemorrágica apresentaram diferentes sintomas. Uma parte deles morreu por causa do sangramento e outra parte morreu sem verter sangue. Houve, ainda, animais que sobreviveram à doença. "Mas todos os roedores infectados com L. interrogans sorovar Canicola apresentaram intenso quadro hemorrágico e morreram, mostrando a agressividade dessa bactéria", explica Fernandes.
A inflamação exacerbada no organismo pode levar a um fenômeno de ativação da coagulação e ocasionar sangramento, por isso Fernandes decidiu observar o efeito de anti-inflamatórios - atualmente, o mais comum é tratar doentes com antibióticos. Hamsters receberam o medicamento antes e quatro dias depois da infecção. Todos os animais com sintomas mais graves morreram, mas alguns tiveram menos hemorragia, sintomas mais amenos e sobreviveram por mais tempo.
Houve, ainda, menos comprometimento dos pulmões nos animais tratados. "A inflamação é uma faca de dois gumes. Você precisa dela para combater a doença, mas se você não a controla, você tem problemas", afirma Fernandes. "Animais que recebem remédios depois de infectados não conseguem combater a doença porque já existiam muitas leptospiras nos rins, mesmo apresentando sintomas mais brandos", completa.
Mais informações pelo e-mail luis.fernandes@butantan.gov.br, com Luís Guilherme Virgílio Fernandes
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